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高效液相色谱法同时检测论文黄酒中的5-羟甲基糠醛和9种多酚

发布日期:2年前 (2019-02-24) / 所属分类:论文网
  

【摘要】  建立了黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚(儿茶素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸、p-香豆酸)的高效液相色谱检测方法。采用diamonsil c18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分离,柱温为42 ℃,检测波长为280 nm,流动相为乙腈和3%乙酸水溶液,梯度洗脱,20 min内10种物质得到了较好的分离。各化合物回归方程的相关系数r为0.9911~0.9995,检出限为0.2~0.5 mg/l; 相对标准偏差rsd≤2.4 %; 10种组分的平均回收率为89.4%~98.3%; 能够满足定量分析要求。实验结果表明,本方法适用于不同种类和年份黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚的检测。

【关键词】  糠醛;多酚;反相高效液相色谱;黄酒

            simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural and nine kinds of phenolic compounds in rice wine using high performance liquid chromatographychen lei,huang xue-song*(department of food science and engineering,jinan university,guangzhou 510632)abstract  an analytical method of reversed phase high performance liquid chromatography (rp-hplc) was developed for simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural and nine phenolic compounds(including (+)-catechin,(-)-epicatechin,chlorogenic acid,rutin,caffeic acid,protocatechuic acid,syringic acid,ferulic acid and p-coumaric acid) in 20 min.ten components were detected and separated successfully by diamonsil c18 column (150 mm×4.6 mm,5 μm) at wavelength of 280 nm and column temperature of 42 ℃,with acetonitrile and 3% acetic acid solution as the mobile phase in gradient elution.the resultant correlation coefficients of the ten compounds were between 0.9911 and 0.9995 with detection limit from 0.2 to 0.5 mg/l,the rsd less than 2.4% and the average recoveries from 89.4% to 98.3%.these experimental results demonstrate that 5-hydroxymethylfurfural and the nine phenolic compounds in different rice wine samples can be determined with the new method for practical uses.

  keywords  hydroxymethylfurfural;polyphenol;reversed phase high performance liquid chromatography;rice wine

  1  引言

  黄酒(rice wine)是我国的特产,历史悠久,含有丰富的营养素与多种活性物质,具有饮用、调味、药用、保健等作用。高效液相色谱法同时检测论文黄酒的这些作用与其所含有的化学成分(如糊精、有机酸、氨基酸、活性肽、维生素、多酚、微量芳香成分等)密切相关[1,2]。其中,多酚是黄酒调味、药用、保健等作用的基础物质,但黄酒中的多酚常难以准确测定。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,hmf)作为一种maillard反应的重要产物,不仅是引起食品风味和褐变的指标成分,而且具有多方面的生理作用 [3~5],受到广泛关注。因此,检测农产品及其加工食品中的多酚和hmf,对于正确评价食品原料及其制品的保健作用和品质具有重要意义。

  目前,高效液相色谱检测单体多酚类物质已有很多报道,但主要集中于检测酚酸类与黄酮类物质方面[6~11]。由于两类多酚的性质差异较大,难以同时测定。若在变波长条件下同时检测hmf和多酚,则需要二极管阵列检测器,而且耗时长[12]。将hmf与多酚类物质以高效液相色谱法同时检测还未见报道。本研究采用反相高效液相色谱(rp-hplc)同时检测黄酒中hmf和上述两类多酚中9种常见的代表性酚类物质,并测定不同品牌不同年份的黄酒样品中多酚和hmf的含量,为不同年份的酒质提供评价依据。

  2  实验部分

  2.1  仪器、原料与试剂

  lc-20at高效液相色谱仪,配备spd-m20a光电二极管阵列检测器(dad,日本岛津公司);diamonsil c18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美国迪马公司);sz-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);溶剂过滤器和0.45 μm微孔滤膜(天津津腾试验设备有限公司)。

  黄酒:从浙江各公司购得目前市场销售量大的两个品牌(分别记为品牌i、品牌ii)3年陈、5年陈、8年陈、10年陈酒样,用于测定其hmf和多酚的含量。

  (+)-儿茶素、(-)-表儿茶素(上海同田生化技术有限公司);阿魏酸(中国医药(集团)上海化学试剂公司);绿原酸(中国药品生物制品鉴定所);5-羟甲基糠醛、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、p-香豆酸(sigma公司); 乙腈(hplc级,美国dikma公司); 冰乙酸(分析纯,天津市化学试剂一厂)。实验用水为二次蒸馏水。

  2.2  色谱条件

  diamonsil c18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);检测温度:42 ℃;检测波长:280 nm;进样量:10 μl;流动相:乙腈,3%乙酸水溶液,梯度洗脱程序见表1。

  表1  hplc梯度洗脱程序(略)

  table 1  gradient eluted program of hplc

  2.3  标准溶液及样品溶液的配制

  准确称取标准品5-羟甲基糠醛、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、芦丁、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸各约10.0 mg,分别用乙腈定容至10 ml,得到每个标准品的标准溶液。分别移取1.0 ml hmf、阿魏酸、丁香酸、p-香豆酸标准溶液和2.0 ml(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、芦丁、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸标准高效液相色谱法同时检测论文溶液,用流动相(v(3%乙酸水溶液)∶v(乙腈)=8∶2)定容至50 ml,得多酚混合标准贮备液,使用时用流动相稀释成不同浓度梯度的标准溶液。

  取不同品牌各年份的黄酒用0.45 μm微孔滤膜过滤,供hplc检测。

  2.4  分析方法的评价

  2.4.1  标准曲线  准确移取混合标准溶液各0.5, 1.0, 2.0, 4.0和8.0 ml,分别定容至10 ml,每个浓度重复进样3次,以各单体酚的平均峰面积与标准溶液中物质的含量作校准曲线,并计算相关系数。

  2.4.2  检出限和精密度的测定  将一定质量浓度的标准溶液逐级稀释,进样。当信噪比等于3时,所对应的标准溶液中所含组分的质量为检出限。将某一浓度的标准溶液重复进样5次,根据结果计算相对标准偏差。
   
  3  结果与讨论

  3.1  检测波长的确定

  通过二极管阵列检测器(dad)扫描得到各物质在紫外光区的最大吸收波长(图1),为了能同时测定这几种物质,同时又避开溶剂的吸收,检测波长确定为280 nm。

  图1  10种物质的紫外光谱图(略)

  fig.1  ultraviolet spectrogram of 10 components

  a.5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,hmf);b.原儿茶酸(protocatechuic acid);c.(+)-儿茶素((+)-catechin);d.绿原酸(chlorogenic acid);e.咖啡酸(caffeic acid);f.(-)-表儿茶素 ((-)-epicatechin);g.丁香酸(syringic acid);h.p-香豆酸(p-coumaric acid);i.芦丁 (rutin); j.阿魏酸(ferulic acid)。

  3.2  色谱条件的优化

  3.2.1  流动相及洗脱比例和流速  考察了0.5%乙酸水溶液-乙腈、2%乙酸水溶液-乙腈和3%乙酸水溶液-乙腈作流动相时的分离效果。结果显示,随乙酸含量的增加,峰形和分离效果变好。考虑到ph太低会损坏色谱柱而导致柱效降低,而且会使基线严重漂移,故选定3%乙酸溶液和乙腈为流动相。通过调整流动相的比例发现,使用线性梯度洗脱时,峰形和分离度都无法达到要求。同时,对比了多种流速效果后,为了缩短分析时间同时获得比较理想的分离效果,最终选定在不同洗脱比例下使用不同流速。
 
  图2  最优分离色谱图(略)

  fig.2  chromatogram of optimized separation

  1.5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural);2.原儿茶酸(protocatechuic acid);3.(+)-儿茶素 ((+)-catechin);4.绿原酸(chlorogenic acid);5.咖啡酸(caffeic acid);6.(-)-表儿茶素 ((-)-epicatechin);7.丁香酸(syringic acid);8.p-香豆酸(p-coumaric acid);9.芦丁(rutin);10.阿魏酸(ferulic acid)。

  3.2.2  进样量的选择  通过比较进样量分高效液相色谱法同时检测论文别为5,10和20 μl的分离效果发现,当进样量过大时,色谱峰会出现拖尾峰或者前延峰,而且分离效果不佳。如果进样量太少,吸收少,有时会检测不到。最终选定进样量为10 μl。

  3.2.3  色谱条件的确定  由以上实验,最终确定分离hmf和多酚类物质的色谱条件是:检测波长280 nm,柱温42 ℃,进样量为10 μl, 3%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱(表1)。在此色谱条件下进样,得到多酚的标准色谱图(图2)。

  由图2可见, 10种物质得到了很好地分离,而且分离时间只有20 min。与已报道的方法[10,13]相比,分离时间及分离效果都得到了明显改善。

  3.3  分析方法的评价

  在已确定的色谱条件下,分别对不同浓度的标准溶液进样分析,根据平均峰面积与标准物质的含量关系进行线性回归,同时测得检出限(表2)。

  表2  10种物质的回归方程、检测限和相对标准偏差(n=5)(略)

  table 2  regression equations ,detection limits and relative standard deviations of 10 compounds(n=5)

  在各相应的线性范围内,相关系数r均大于0.99,表明线性关系良好,而且精密度高(相对标准偏差为1.2%~2.4%),能满足定量分析的要求。

  3.4  样品的测定及回收率的检测

  取3年陈的品牌i酒样,加入适量混合标准品溶液,混合均匀后,按“2.2”节色谱条件测定加标回收率,由表3可见,样品各组分的加标回收率为89.4%~98.3%; rsd为2.6%~5.3%。

  在2.2所述条件下,分别将两品牌4个不同陈化年份的酒样滤后进样,测定其中各物质的含量(图3,表4)。

  表3  10种物质的回收率(n=3)(略)

  table 3  recoveries of 10 components by hplc analysis(n=3)

  图3  黄酒样品中多酚的色谱图(略)

  fig.3  chromatogram of hmf and phenolic compounds in different rice wines

  峰号同图2(peak numbers are same as in fig.2).

  表4  各黄酒样品中10种物质的含量测定结果(n=3)(略)

  table 4  determination results of 10 components in different rice wine samples(n=3)

  “-”未检出(not detected)。
   
  由表4可以看出,黄酒中hmf含量随时间高效液相色谱法同时检测论文延长而增加。这是因为在黄酒陈化过程中一直进行maillard反应所致。但是8年陈黄酒中hmf含量要高于10年陈,这可能由于陈化到一定时间后maillard反应第3阶段占优势,hmf与其它物质交联导致含量降低[14];大部分多酚含量随陈化时间增长而下降,这可能由于陈化过程中多酚与蛋白交联产生沉淀而导致含量降低,这表明陈化时间越长的黄酒中多酚等活性成分含量越低,从营养保健的角度讲,并非越陈越好;有些多酚随陈化时间延长而含量增加,是因为其样品并非为同一批原料酿造而存在一定范围内的差异。

【参考文献】
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